肾纤维化以细胞外基质（Extracellular Matrix，ECM）的过度沉积导致组织瘢痕形成为特征，是多种慢性肾脏病（Chronic Kidney Disease，CKD）的共同终点。目前尚无直接针对肾纤维化的特异性疗法，因此亟需更深入地了解肾纤维化的发生和发展机制。肾纤维化病变并非均匀分布于整个肾实质，而是从某些局部部位开始，形成微小的纤维化“生态位”[1]。这一“生态位”提供了一个独特的组织微环境，可以自发地促进成纤维细胞的激活，这是肾纤维形成的第一步。“生态位”形成后，ECM作为细胞周围的蛋白质三维网络逐渐沉积和扩张，导致肾实质纤维化灶的形成，影响周围细胞的功能，改变其表型和功能。虽然改变的ECM网络在调节组织纤维化中的作用得到了很好的认识，但对纤维化肾脏中ECM蛋白图谱及其变化知之甚少。
基于此，2023年2月，来自南方医科大学南方医院的刘友华/傅海燕团队在Kidney International 发表题为“Proteomic landscape of the extracellular matrix in the fibrotic kidney ”的文章，解析了纤维化肾脏中ECM的蛋白质组成，鉴定并验证了9种标志蛋白作为ECM的核心特征蛋白集，并深入研究了谷胱甘肽过氧化物酶3 （GPX3）在CKD中的作用和机制。
首先，研究人员使用脱细胞肾组织支架（Kidney Tissue Scaffolds，KTS），结合无偏质谱蛋白质组学，探究了正常肾脏（Ctrl-KTS）和纤维化肾脏（UIRI-KTS）的ECM蛋白组成。在Ctrl-KTS中共鉴定出873个蛋白，在UIRI-KTS中鉴定出1023个蛋白，多数蛋白聚集于胶原蛋白超家族（PF01391蛋白家族）。并且Ctrl-KTS和UIRI-KTS之间鉴定出大量差异表达蛋白，这些差异蛋白富集于炎症和纤维化相关的信号通路，包括过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路、ECM受体相互作用、氧化磷酸化等（图1）。
图片图1 正常和纤维化肾脏ECM的蛋白组学分析
通过对ECM蛋白的进一步聚类分析，研究人员发现Ctrl-KTS组和UIRI-KTS组在6类ECM蛋白的表达均有显著差异，这些差异表达的ECM蛋白在多种纤维化相关生物过程中富集（图2）。
图片图2 ECM蛋白在正常和纤维化肾脏之间的差异
接下来，研究人员特别关注了纤维化肾脏中9种标志ECM蛋白的变化，包括GPX3、TG2、LOXL2、LBP、S100A8、SERPINA10、FN1、TNC和FBN1。其中， GPX3是唯一在UIRI-KTS中表达下调的蛋白。这些蛋白的变化在UUO和UIRI小鼠模型中得到了验证（图3）。研究人员分别在小鼠模型和肾纤维化病人组织中探究了这些蛋白的来源和定位，得到了一致的结果：GPX3在健康肾脏中大量表达且主要定位于肾小管上皮，纤维化后几乎检测不到其表达。而其余蛋白在健康肾脏中表达很低，肾纤维化后表达明显上调，TG2、SERPINA10及FBN1定位于肾小管上皮， LOXL2表达于肾间质， LBP和S100A8定位于肾脏不同的区室，TNC和FN1在肾间质成纤维细胞中表达，说明各种类型的肾细胞有助于ECM蛋白沉积，并参与了纤维化微环境的形成。
图片图3 正常和纤维化肾脏差异表达ECM蛋白的验证
由于GPX3是细胞外谷胱甘肽过氧化物酶，其缺失可能导致组织中氧化应激微环境的形成。因此研究人员探究了GPX3在肾纤维化中的功能，通过UUO小鼠术前1天尾静脉注射对照shRNA或GPX3-shRNA来敲低GPX3，研究团队发现GPX3的敲低可以显著促进肾纤维化的进展，促进FN1、α-SMA和Collagen I的表达（图4）。深入的机制探究表明GPX3的缺失通过激活NOX2/ROS/p38 MAPK通路，产生氧化应激微环境，从而促进肾纤维化发展。
图片图4 GPX3下调加重UUO小鼠肾纤维化
最后，研究人员为证明GPX3的肾脏保护作用，通过小鼠尾静脉注射GPX3的过表达载体来恢复其在体内的表达，结果表明过表达GPX3通过抑制NOX2/ROS/p38 MAPK通路抑制了肾纤维化的进展。
文章结论与展望
综上，本研究揭示了肾纤维化后ECM的蛋白质组学改变，鉴定并验证了9种ECM蛋白。并且证明GPX3的缺失通过NOX2/ ROS/p38 MAPK信号级联促进肾纤维化。本研究为纤维化微环境的分子组成和潜在机制提供了重要的见解。
Kidney International 同期对该工作发表述评，意大利贝加莫大学的Andrea Remuzzi教授和日本东京大学Masaomi Nangaku教授高度赞扬此工作，并评论：该项工作使用化学和机械相结合的方法使肾脏组织脱细胞，这种方法对于绘制发生纤维化的ECM蛋白质图谱十分关键。研究过程中，该工作通过结合蛋白质组学和转录组学，明确并验证了纤维化ECM中最重要的差异表达蛋白GPX3，同时利用非病毒基因递送的方法，证实GPX3在减少ROS影响和改善肾纤维化方面的重要作用。该研究成果促进了领域对肾纤维化发展机制以及肾纤维化微环境的认识，对于开发CKD的新疗法具有一定的启发。
参考文献：
[1] Li L, Fu H, Liu Y. The fibrogenic niche in kidney fibrosis: components and mechanisms. Nat Rev Nephrol. 2022;18:545–557
原文来源：
https://mp.weixin.qq.com/s/ZqX6mu69wM9vddUjZiLg-w
撰文 | 刘云婧
责编 | 李娜